Perfil de pacientes com urticária crônica espontânea submetidos ao tratamento com omalizumabe em Chapecó, SC / Profile of patients with chronic spontaneous urticaria treated with omalizumab in Chapecó, south of Brazil

Introdução: A urticária crônica espontânea é caracterizada por lesões máculo-papulares eritematosas, associadas a prurido e angioedema, que não possui estímulo externo reconhecido e de difícil controle. A primeira e a segunda linha terapêutica, disponibilizadas pelo Sistema Único de Saúde, não apresentam resultados significativos, os quais se tornam refratários. O omalizumabe, considerado terceira linha terapêutica e que não é amplamente disponibilizado pelo Sistema Único de Saúde, pode apresentar resultado significativo na interrupção dos sintomas da doença. Objetivo: O presente estudo tem como objetivo avaliar pacientes com urticária crônica espontânea que usaram ou estão em uso de omalizumabe. Métodos: Trata-se de um estudo observacional transversal do tipo série de casos, cuja análise foi feita através dos prontuários, com população de 34 pacientes com urticária crônica espontânea submetidos ao tratamento com omalizumabe no Instituto de Olhos de Santa Catarina (IOSC). Resultados: Constatou-se no estudo que a maioria dos pacientes com urticária crônica espontânea em uso de omalizumabe é constituída do sexo feminino (76,5%) e idade média de 41 anos. A doença mais associada à urticária crônica espontânea foi depressão (38,2%). O sucesso do tratamento com omalizumabe é medido pelo questionário UAS7 (Urticaria Activity Score), o qual, segundo os dados dos prontuários, todos os pacientes apresentavam resultado maior que 35 pontos antes do uso da medicação, e 32 conseguiram alcançar um índice de 0 após o uso do omalizumabe, variando apenas no tempo de tratamento. Conclusão: A urticária crônica espontânea é uma doença que não tem cura e possui alta refratariedade, mas pode ter seus sintomas reduzidos, principalmente com o uso do omalizumabe, que se mostrou eficiente nos casos analisados.

Introduction: Chronic spontaneous urticaria is a disease characterized by erythematous maculopapular eruption, associated with itching and angioedema, that has no recognized external stimulus and is difficult to control. First- and second-line treatments, available through the Brazilian Unified Health System, do not yield meaningful results, and patients become refractory. Omalizumab, considered a third-line treatment and not widely available through the Brazilian Unified Health System, may yield meaningful results in halting disease symptoms. Objective: To evaluate patients with chronic spontaneous urticaria who have used or are using omalizumab. Methods: We conducted a cross-sectional case series observational study with a review of the medical records of 34 patients with chronic spontaneous urticaria treated with omalizumab at the Eye Institute of Santa Catarina, south of Brazil. Results: Most patients with chronic spontaneous urticaria receiving omalizumab were female (76.5%) with a mean age of 41 years. The disease most commonly associated with chronic spontaneous urticaria was depression (38.2%). Omalizumab treatment success was measured with the Urticaria Activity Score (UAS7). Based on data extracted from the medical records, all 34 patients had a score greater than 35 before treatment. After receiving omalizumab, 32 patients managed to reach a score of 0, differing only in the duration of treatment. Conclusion: Chronic spontaneous urticaria is an incurable, highly refractory disease, but its symptoms can be reduced mainly with the use of omalizumab, which proved to be effective in the cases analyzed here.

Regressão da polipose nasal induzida pelo dupilumabe / Regression of dupilumab-induced nasal polyps

Relato de caso de paciente com rinossinusite crônica com polipose nasal em tratamento com dupilumabe. São descritos os aspectos clínicos e o impacto na qualidade da vida do paciente. Imagens tomográficas evidenciam a melhora do processo inflamatório e a regressão dos pólipos nasais.

We report the case of a patient with chronic rhinosinusitis with nasal polyps treated with dupilumab. The clinical features and impact on the patient's quality of life are described. Computed tomography shows improvement of the inflammatory process and regression of the nasal polyps.

Beneath the surface: a case report of metastatic iridociliary ring melanoma treated with pembrolizumab / Abaixo da superfície: relato de caso de melanoma metastático iridociliar em anel tratado com pembrolizumabe

ABSTRACT Iridociliary ring melanoma is an uncommon type of uveal melanoma. Clinical manifestation varies from asymptomatic cases to masquerade syndromes mimicking refractory glaucoma. Treatment options include radiotherapy and enucleation. Management of metastatic uveal melanoma remains discouraging. Novel therapies using immune checkpoint inhibitors are currently under study. We present a case of a 54-year-old Hispanic woman with progressive vision loss due to metastatic ring melanoma with anterior chamber seeding treated with pembrolizumab.

RESUMO O melanoma iridociliar em anel é um tipo incomum de melanoma uveal. As manifestações clínicas variam desde casos assintomáticos até síndromes mascaradas que mimetizam um glaucoma refratário. As opções de tratamento incluem radioterapia e enucleação. O manejo do melanoma uveal metastático continua desanimador. Novas terapias usando inibidores de checkpoint imunológico estão atualmente em estudo. Apresentamos o caso de uma mulher hispânica de 54 anos com perda progressiva da visão por um melanoma metastático em anel, com semeadura de câmara anterior, tratada com pembrolizumabe.

Dupilumabe no tratamento de rinossinusite crônica com pólipo nasal em adolescente / Dupilumab in the treatment of chronic rhinosinusitis with nasal polyps in adolescents

O uso do anticorpo monoclonal dupilumabe em adultos tem possibilitado o controle da inflamação crônica, reduzindo significativamente o tamanho e a recorrência de novos pólipos, melhorando os sintomas nasais e, consequentemente, a qualidade de vida desses indivíduos. Relatamos o caso de uma adolescente que evidencia a eficácia de dupilumabe no tratamento da rinossinusite crônica com pólipo nasal.

The use of the monoclonal antibody dupilumab in adults has allowed the control of chronic inflammation, significantly reducing the size and recurrence of new polyps, improving nasal symptoms, and, consequently, quality of life. We report a successful case of dupilumab use in an adolescent for the treatment of chronic rhinosinusitis with nasal polyps.

Sêmen ovino e caprino imunossexado e diluído em meio de conservação à base de água de coco em pó (ACP101/102c) / Ram and goat semen immunosexed and diluted in powdered coconut water-based preservation medium (ACP101/102c)

Sperm sexing aims to separate sperm populations in carriers of the "X" or "Y" chromosome. Currently, flow cytometry is a technique that allows greater accuracy; however, it causes structural changes in sperm, reduces viability, and has a high cost. As a result, other methods have been researched, including immunosexing, which uses monoclonal antibodies to detect sex-specific surface antigens. Thus, the objective of this study was to evaluate the immunosexing technique using a monoclonal antibody against sex-specific protein (HY) in the conservation of ram and goat semen in ACP101/102c. Ejaculates from five rams and five goats were collected with the aid of an artificial vagina; they were evaluated and submitted to the immunosexing protocol, according to the manufacturer's recommendations, using the Monoclonal Antibody Kit specific for mammalian sperm with "Y" chromosomes (HY; HY Biotechnology, Rio de Janeiro, RJ, Brazil). After sexing, the supernatant was resuspended in the cryopreservation diluent: ACP ram (ACP101/102c + 20% egg yolk + 7% glycerol) and ACP goat (ACP101/102c + 2.5% egg yolk + 7% glycerol), packaged in 0.25 mL straws, refrigerated at 4°C, stabilized for 30 min, frozen in liquid nitrogen vapor (-60°C) for 15 min, immersed in liquid nitrogen, and stored in cryogenic cylinders. The samples were evaluated in natura (T1), after immunosexing (T2) and after thawing (T3) for sperm motility subjectively using conventional microscopy (40x). Plasma membrane integrity (IMP) and sperm cell morphology were evaluated by the smear staining technique using eosin-nigrosine dye, and the percentages of healthy and morphologically defect spermatozoa were determined. In the evaluation of ram semen regarding sperm motility and IMP, no statistically significant differences were observed between treatments after sexing in the evaluation of absolute data (P > 0.05), with the difference being observed only between T1 and T2, and T3 (P < 0.05). Regarding the relative percentage and sperm morphology, no statistically significant differences were observed (P > 0.05). Regarding the evaluation of goat semen samples, the motility parameters were consistent with the technique submitted; however, the IMP data did not appear as expected, requiring further evaluation for a better assessment of the technique for this species. The data obtained from ram semen submitted to the immunosexing protocol, regarding the absolute evaluation of motility and IMP, demonstrated that the non-sexed semen (T1) was superior to the sexed treatments (T2 and T3); however, it is noteworthy that freezing started with approximately 50% of the cells, since the immunosexing technique results in a loss of viability of approximately 50% of the sperm, which corresponds to the ratio of sperm carrying the X chromosome. In addition, when the data in this study were transformed into relative values, no statistical differences were observed, indicating that the immunosexing protocol, as well as the freezing protocol, did not significantly affect the quality of ram sperm cells. In relation to the immunosexing of goat semen, future studies should be conducted in vitro to define a more appropriate protocol for the species and, in addition, in vivo studies should be performed to prove the quality of the technique. It was concluded that the immunosexing process using a monoclonal antibody against sex-specific protein (HY) associated with the use of powdered coconut water diluent (ACP101/102c) in the cryopreservation of semen proved to be efficient in the in vitro evaluation of ovine species.(AU)

Guia prático de atualização: medicamentos biológicos no tratamento da asma, doenças alérgicas e imunodeficiências / Practical update guide: biological drugs in the treatment of asthma, allergic diseases and immunodeficiencies

O presente guia apresenta revisão extensa sobre imunobiológicos utilizados, liberados e ainda sob estudo, para o tratamento da asma, doenças alérgicas e imunodeficiências. Além das características físico-químicas de alguns desses fármacos, são revisadas as indicações e os resultados de estudos clínicos realizados para avaliar eficácia e segurança. Separados por doença específica, são apresentados os principais agentes disponíveis e aprovados para utilização segundo as normas regulatórias nacionais.

This guide presents an extensive review of immunobiological drugs used, approved and/or under investigation for the treatment of asthma, allergic diseases and immunodeficiencies. In addition to the physicochemical characteristics of some of these drugs, their indications and results of clinical studies evaluating efficacy and safety are reviewed. The main agents available and approved for use in each specific disease according to national regulatory standards are presented.

Infliximabe é eficaz em ceratite ulcerada periférica de difícil controle. Um relato de três casos / Infliximab is effective in difficult-to-control peripheral ulcerative keratitis. A report of three cases

Ceratite ulcerada periférica é causada por um processo inflamatório e destrutivo da córnea periférica perilimbar. Essa inflamação se deve à deposição de imunocomplexos nessa região da córnea e nos vasos adjacentes a ela. Pode ser idiopática ou uma manifestação de doença sistêmica como artrite reumatoide, vasculites de pequenos vasos associadas ao ANCA, à policondrite recidivante, ao lúpus eritematoso sistêmico e à doença de Crohn. O tratamento inclui o uso de corticoide em dose alta e em alguns casos o uso concomitante de imunossupressores, como metotrexate, azatioprina, micofenolato mofetil, ciclofosfamida ou ciclosporina. O uso de agentes imunobiológicos pode ser uma estratégia nos casos de difícil controle. Os autores descrevem o tratamento de três pacientes que após falha ao uso de corticoide ou imunossupressores apresentaram boa resposta após o uso de infliximabe.

Peripheral ulcerative keratitis is caused by an inflammatory and destructive process of the perilimbal peripheral cornea. This inflammation is due to immune complex deposition in this region of the cornea and in adjacent vessels. It can be idiopathic, or a manifestation of systemic disease such as rheumatoid arthritis, vasculitis of small vessels associated with ANCA, relapsing polychondritis, systemic lupus erythematosus and Crohn's disease. Its treatment includes the use of high-dose corticosteroids and, in some cases, the concomitant use of immunosuppressants such as methotrexate, azathioprine, mycophenolate mofetil, cyclophosphamide or cyclosporine. The use of immunobiological agents can be a strategy in cases of difficult control. The authors describe the treatment of three patients who, after failure with the use of corticosteroids or immunosuppressants, showed good response after the use of infliximab.

Construção e expressão de anticorpo humanizado a partirdo anticorpo monoclonal contra proteína de 70 kDa de Sporotrix schenckii (P6E7) / Construction and expression of humanized antibody from the monoclonal antibody against the protein of 70 kDa Sporotrix schenckii (P6E7)

Sporothrix shenckii é o agente etiológico da esporotricose, micose de carater crônico e de ampla distribuição mundial. No Brasil, vem crescendo o número de casos da doença, bem como a incidência de formas clínicas graves ou atípicas. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um anticorpo monoclonal contra o componente antigênico proteíco de 70 kDa, secretado pelas células leveduriformes de S. schenckii, denominado anticorpo monoclonal (AcMo) P6E7. Este AcMo apresentou atividade profilática e terapêutica na esporotricose experimental, no entanto, este anticorpo possui origem murina, o que pode gerar uma resposta imunogênica quando administrado em humanos, impossibilitando sua utilização por tempo prolongado. Visando sua possível utilização no tratamento da esporotricose humana, a nossa proposta foi a humanização do AcMo P6E7 na forma de FvFc (Fv-linker- Fc) através de engenharia genética. Inicialmente construimos duas versões uma humanizada e outra quimérica do AcMo contra a fração de 70 kDa do antigeno de S. schenckii. Os anticorpos foram expressos em vetores de expressão dicistrônicos e produzidos com eficiência e estabilidade estrutural em células de mamíferos da linhagem CHO. Posteriormente, esses anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade e analisados quanto a sua capacidade de ligação ao fungo e função efetora. Verificamos que os FvFcs construídos foram capazes de se ligar a porção de 70 kDa do antígeno de S. schenckii. Através de ensaios de fagocitose, constatamos que os fragmentos FvFc do P6E7 humanizado e quimérico foram capazes de opsonizar as leveduras de S. schenckii aumentando, assim, o índice fagocítico em macrófagos humanos. Esses dados em conjunto, sugerem a possível utilização do anticorpo construído no tratamento da esporotricose humana

Sporothrix shenckii is the etiological agent of sporotrichosis, a chronical fungal infection that shows a worldwide distribution. In Brazil, there is a growing number of cases of sporotrichosis, as well as the incidence of severe or atypical clinical forms. Our research group developed a monoclonal antibody (mAb) against the fungal antigenic component a protein of 70 kDa, secreted by S. schenckii yeasts called P6E7. This mAb showed prophylactic and therapeutic activity in experimental sporotrichosis, however, this antibody has murine origin, which can generate an immune response when administered to humans, precluding their use for prolonged time. For its possible use in the treatment of human sporotrichosis, our proposal is the humanization of mAb P6E7 through genetic engineering. Initially, we built two versions of the original antibody: an humanized version and a chimeric antibody both against the 70 kDa fraction from S. schenckii antigen. The antibodies were expressed in dicistronic expression vectors and were efficiently produced in mammalian cells CHO strain, showing good structural stability. Subsequently, these antibodies were purified by affinity chromatography and assayed for their binding ability to the fungus and effector function. We found that the built os FvFcs (Fv-linker- Fc) fragments were capable of binding to the 70 kDa portion of S.schenckii antigen. Through phagocytosis assays, we found that the FvFc fragments from the humanized and chimeric P6E7 were able to opsonize S. schenckii yeasts, thus increasing the phagocytic index in human macrophages. Together, These data suggest the potential use of the antibodies constructed in the treatment of human sporotrichosis

Crohn's Disease: current state of biological therapy / Doença de Crohn: estado atual da terapia biológica

The inflammatory bowel diseases (IBD) are defined as nonspecific chronic intestinal inflammations with possible systemic involvement. IBD have unknown etiology. The inflammatory process is complex and heterogeneous, both as to the characterization of the disease that affects the digestive tract, without an intelligible pattern of revelation and balance, and in its different systemic damages when including the extensive and severe extraintestinal symptoms. Aparently, the natural history of the disease is irregular in relation to the offending agent system and the attacked system, both in the intestinal and extraintestinal teguments. Isolated aspects showing irregularity in this balance gives us the notion that IBD, especially Crohn's disease, can be caused by the stimulation of an immune response caused by damaging agents (intestinal bacteria), but mediated by inadequate genetic factors, whose expressions determine different individual susceptibilities. These observations have been shown in genetic studies that emphasize the importance of pathological interaction between host and bacteria subsidized by a genomic region that contains genes producing proteins (NOD2 - nucleotide-binding oligomerization domain containing 2) participating in an enhanced defense response by the tissue. Increased numbers and the activation of these cells in the intestinal mucosa elevate local levels of tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin-1ß, interferon-γ, and cytokines of the interleukin-23-Th17 pathway. So, it can be assumed that the susceptibility, which is a result of genetic alterations, is connected to an exaggerated response in the pro-inflammatory phase because of a dysfunction in the intestinal immune system. The identification of tumor necrosis factor (TNF-α) as the active element in the pro-inflammatory inadequate response gave rise to the heightened production of biological substances that could block TNF-α, at different levels, opening a large field of view to new treatment of IBD. (AU)

As doenças intestinais inflamatórias (DII), definidas como inflamação crônica inespecífica dos intestinos, com eventual comprometimento sistêmico, são de etiologia desconhecida. O processo inflamatório é complexo e heterogêneo, tanto na caracterização da doença que atinge o trato digestório, onde não obedece a um padrão inteligível de revelação e de equilíbrio, como em seus variados danos sistêmicos, quando englobam os extensos e graves sintomas extraintestinais. Tudo indica que, na história natural da doença, há uma notável irregularidade entre agente agressor e sistema agredido, tanto a nível intestinal, como nos tegumentos extraintestinais. Aspectos isolados ou de conjunto que denotam irregularidade nesse equilíbrio dão-nos a noção de que as DII, sobretudo a doença de Crohn, podem ser originadas pela estimulação de uma resposta imune, provocada por agentes agressores (bactérias intestinais, por exemplo), mas mediadas de forma inadequada por fatores genéticos, cujas expressões determinam diferentes susceptibilidades individuais. Essas observações têm sido realçadas em estudos genéticos, que destacam a importância da interação patológica entre hospedeiro e bactéria, subsidiados por uma região genômica que contém genes produtores de proteínas (proteína de dois domínios de oligomerização de nucleotídeos - NOD2), com participação na resposta de defesa tecidual pela sinalização da ativação do sistema de resposta imune; por genes autofágicos e por vias de reações com componentes de interleucinas-23 com a concorrência de linfócitos-T (Th-17). Nessas condições, o que pode ser suposto é que a susceptibilidade, que decorre de alterações gênicas, esteja ligada a uma exagerada resposta na fase pró-inflamatória, decorrente de uma disfunção do sistema imune intestinal. A identificação do fator de necrose tumoral (TNF-α) como o elemento ativo na resposta pró-inflamatória inadequada e exacerbada ensejou a produção de substâncias biológicas que fossem capazes de bloquear o TNF-α, em diferentes níveis, abrindo um campo grande de perspectiva para novo tipo de tratamento das DII. (AU)

Construção de uma biblioteca de fragmentos de anticorpos monoclonais de galinhas com cadeia única (scFv) por phage display com reatividade cruzada para estirpes heterólogas do vírus da bronquite infecciosa aviária / Construction of an avian single chain monoclonal antibodies (scFv) library by phage display that cross-reacted with heterologous avian infectious bronchitis virus strains

Anticorpos monoclonais constituem a base de vários testes usados na detecção e na identificação de antígenos. Nesse contexto, tais imuno-reagentes têm sido extensivamente empregados na identificação de estirpes virais envolvidas na etiologia de surtos de bronquite infecciosa a campo, permitindo o aperfeiçoamento das técnicas de detecção e caracterização antigênica do vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBI). No presente estudo, uma biblioteca de fragmentos de anticorpos de galinha originalmente preparada por phage display contra a estirpe vacinal (H120) do VBI foi usada para a seleção de fragmentos de anticorpos recombinantes com reatividade cruzada para as estirpes heterólogas IBVPR01 e IBVPR05, isoladas de surtos a campo no Brasil e a estirpe SE-17, isolada nos Estados Unidos. Após três ciclos de panning, foi identificado, pelo ELISA, um conjunto de 15 anticorpos scFv expressos em fagos e com reatividade cruzada para essas mesmas estirpes do VBI. A análise por Western-blotting revelou que dois desses clones apresentavam fagos expressando fragmentos de anticorpos monoclonais com reatividade cruzada para a nucleoproteína N das três estirpes do VBI e também para a forma recombinante dessa nucleoproteína derivada da estirpe M41. Concluindo, os fragmentos de anticorpos monoclonais recombinantes scFv-N produzidos em fagos interagem com um epítopo mais conservado da proteína N do VBI e apresentam um grande potencial para utilização na detecção e no diagnóstico direto desse vírus.

Monoclonal antibodies are the basis of various techniques used for antigen detection or characterization, and their use is specially recommended for the identification of viral strains involved in the etiology of infectious bronchitis outbreaks. These antibodies are homogeneous, highly specific and fully characterizable, allowing the improvement of immunological techniques detection and antigenic characterization of avian infectious bronchitis virus strains (IBV). A phage display library was used, which was prepared previously against the IBV vaccine strain (H120) for the selection of new scFv antibody fragments specific for heterologous IBV strains isolated from outbreaks in Brazil (IBVPR01, IBVPR05) and USA (SE-17). After three cycles of panning, a set of 15 scFv antibodies were expressed in phages and cross-reacted in ELISA with these three viral strains. Western-blotting analysis showed that two of the clones were expressing scFv specific for the nucleoprotein of these IBV strains, as well as to the recombinant form of this protein derived from M41. In conclusion, the recombinant fragments of monoclonal antibodies expressed in phage have a great potential for future use in immunodiagnostic techniques and to study the evolution of infectious bronchitis virus.

Anticorpos anti-intimina: análise da reatividade dos anticorpos policlonal e monoclonal, clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples (scFv) do anticorpo monoclonal / Anti-intimin antibodies: polyclonal and monoclonal reactivity analyzes, cloning and expression of single chain fragment variable (scFv) of monoclonal antibodies

Intimina é o principal fator de virulência na patogênese de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). A detecçãode EHEC e EPEC típica ou atípica é de fundamental impotância na definição da conduta terapêutica das infecções promovidas por E. coli, que ainda são a principal causa de diarreia aguda em crianças e adultos em muitos paises desenvolvidos e em desenvolvimento. Anticorpos são ferramentas importantes na detecção de diversos patógenos. Neste trabalho avaliou-se a sensibilidade e especificidade dos anticorpos policlonal e monoclonal anti-intimina frente a isolados de EPEC e EHEC por immunoblotting. Os anticorpos apresentam 100% de especificidade e a sensibilidade foi de 97%, 92% e 78%, quando se utilizou a fração enriquecida em IgG do soro de coelho, antissoro de rato e anticorpo monoclonal, respectivamente. Esse anticorpo monoclonal anti-intimina foi caracterizado como IgG2b e 1 μg desse corpo reconheceu 0,6 μg de intimina purificada com uma constante de dissociação de 1.3 x 10&sup-8; M. A menor reatividade do anticorpo monoclonal em relação aos anticorpos policlonais levou-nos à clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples desse anticorpo (scFv). Para isto, o mRNA do hibridoma anti-intimina foi extraído, reversamente transcrito para cDNA e amplicadas as cadeias leve e pesada da fração variável do anticorpo, utilizando iniciadores aleatórios comerciais. As cadeias amplificadas foram ligadas ao vetor pGEM-T Easy e sequenciadas. Iniciadores específicos foram desenhados e utilizados em uma estratégia de amplificação e união das cadeias, formando o scFv, que por sua vez foi clonado no vetor de expressao pAE. Linhagem E. coli BL 21(DE3)pLys foi transformada com o plasmídeo pAE-scFv anti-intimina e submetida a indução proteíca. O scFv anti-intimina foi expresso de forma insolúvel, solubilizado, purificado e submetido ao ensaio de refolding. O rendimento obtido foi de 1 mg de proteina por 100mL...

Intimin is the major virulence factor involved in the pathogenesis of enteropathogenic Escherichia coli(EPEC) and enterohemorrhagic Escherichia coli(EHEC). The detection of EHEC and typical or atypical EPEC has fundamental importance in defining the therapeutic management of infections causes by E. Coli, which are still the leading cause of acute diarrhea in children and adults in many developed and developing countries. Antibodies are important tools in the detection of several pathogens. In this study it was evaluated the sensitivity and specificityit of polyclonal and monoclonal antibodies against intimin in the detection of EPEC AND EHEC by immunobloting. All employed antibodies showed 100% specifity and sensitivity was 97%, 92% and 78% for rabbit anti-intimin IgG-enriched fraction, rat antisera and monoclonal antibody, repectively. This anti-intimin monoclonal was characterized as IgG2b and 1 μg recognized 0.6 μg of purified intimin with a dissociation constant of 1.3 x 10&sup-8;M. The less extend reactivity of monoclonal led us to clone and express the single chain fragment variable of this antibody (scFV). Thus, the anti-intimin hybridoma mRNA was extrated, reverse transcribed to cDNA and the light and heavy chains of variable fragment of the antibody were amplified using commercial random primers. The chains were amplified, ligated to the pGEM-T Easy vector and the insert was sequenced. Specific primers were designed and used in strategy to amplify and link the chains, obtaining the scFv, wich was cloned into the pAE expression vector. E. coli BL21(DE3)plys was transformed with the pAE-scFv anti-intimin plasmid and subjected to induction to protein expression. The scFv anti-intimin, expressed in the insoluble fraction, was purified and submitted to refolding. The yield was 1 mg of protein per 100 mL of bacterial culture. To test the functionalityof scFv, ELISA and immunofluorescence assays were performed. The results showed 275 ng of scFv...

Desenvolvimento de técnicas de imunoensaio para detecção de microcistina em amostras ambientais / Development of immunoassay techniques to detect microcystin in environmental samples

A contaminação da água para consumo humano por toxinas produzidas por cianobactérias é um problema de saúde pública e das autoridades em todo o mundo. Microcistina-LR (MCLR) é uma cianotoxina heptapeptídica cíclica que inibe as proteínas fosfatases PP1 E PP2A nos hepatócitos. Microcistinas são produzidas por diversos gêneros de cianobactérias e mais de 70 variações estruturais têm sido caracterizadas em florações naturais. Por serem haptenos, as microcistinas são incapazes de induzir uma resposta imune em animais. Conseqüentemente, foi necessário aplicar métodos de conjugação envolvendo a adição de uma proteína carreadora, mcKLH (cationized Keyhole Limpet Hemocyanin). Portanto, o objetivo inicial desta tese foi o de obter anticorpos monoclonal (em camundongos) e policlonal (em coelho) anti- MCLR. Com relação ao anticorpo monoclonal foram obtidos 9 hibridomas (k₂9, k₂10, k₃17, k₂48, k₂84, k₂90, k₂161, k₂226, k₂232), sendo que apenas 5 se mostraram estáveis (k₂9, k₃17, k₂48, k₂84, k₂232). Estes foram selecionados para serem isotipados, expandidos em líquido ascítico, purificados em coluna cromatográfica de proteína-A e titulados. Dentre estes cinco hibridomas secretores de anticorpos, o clone k₃17 foi o que melhor reconheceu (mais específico) a toxina MCLR. Os anticorpos do sobrenadante de meio de cultura do hibridoma e o fluido ascítico purificado foram identificados pelo ensaio ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) previamente padronizado. Mesmo sensibilizando a placa de ELISA com diferentes antígenos, tais como MCLR-cBSA, MCLR, MCLR, MCRR, MCYR e MCLA, o clone 17 foi o que apresentou melhor linearidade frente às variantes de microcistina. Portanto, o clone 17 (isótipo IgG1) obtido é muito promissor e será usado para detecção de MCLR na água para consumo humano através do...

The contamination of drinking water by cyanobacterial toxins is a public health issue and a concern for water authorities throughout the world. Microcystin-LR (MCLR) is a hazardous cyclic heptapeptide cyanotoxin, which inhibits protein phosphatase PP1 and PP2A in hepatocytes. Microcystins are produced by several genera of cyanobacteria and presents more than 70 structural variations characterized in natural blooms. As haptens, microcystins are unable to invoke an immune response in animals. Consequently, the application of conjugation methods with an additional carrier protein, the KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) was necessary. The main objective of this study was to obtain monoclonal (in mice) and polyclonal (in rabbits) antibodies for reacting against MCLR. In what refers to monoclonal antibodies, 9 hybridomas (k₂9, k₂10, k₃17, k₂48, k₂84, k₂90, k₂161, k₂226, k₂232) were obtained; however only 5 were stables (k₂9, k₃17, k₂48, k₂84, k₂232). These were selected to be isotyped, expanded in ascitic fluid, purified by protein-A column chromatography and then, they were titrated. Out of these five antibody-secretor hybridomas, clone k₃17 was the best to recognize (more specific) the MCLR toxins. Antibodies in hybridoma cell culture supernatant and purified ascites fluid were identified by ELISA assay (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) as prior standardized. Even when sensitizing ELISA plate with different antigens, as MCLR-cBSA, MCLR, MCLR, MCRR, MCYR and MCLA, clone 17 presented the best linearity against microcystin variants. Therefore, the obtained clone 17 (isotype IgG1) is a promising clone and shall be used for detecting MCLR in drinking water through the development of a competitive ELISA immunoassay kit. In what refers to the polyclonal antibody, MCLR-mcKLH was used as...

Macroglobulinemia de Waldenström: remissão completa após tratamento com rituximabe / Successful outcome in Waldenström's macroglobulinemia treated with rituximab

A macroglobulinemia de Waldenstrõm (MW) é uma patologia rara dos linfócitos B caracterizada pela produção monoclonal de IgM, e que pode manifestar-se clinicamente com fadiga, astenia, perda de peso, sangramento de mucosas e do trato gastrintestinal, lifonodonomegalias, hepatoesplenomegalia e alterações neurológicas. A doença é mais comum em pacientes idosos, e seus sintomas são decorrentes da hiperviscosidade sangüínea. Na MW observa-se hipergamaglobulinemia com pico monoclonal na eletroforese de proteínas séricas, níveis elevados de IgM e demais imunoglobulinas normais ou diminuídas, imunofenotipagem com linfócitos B CD19+, CD20+ e CD24+, aspirado de medula óssea hipercelular, e biópsia de medula óssea hipercelular com infiltração difusa de linfócitos, linfócitos plasmocitóides e plasmócitos. Atualmente, anticorpos monoclonais estão sendo usados na terapêutica da MW com grande sucesso. O rituximabe, anticorpo monoclonal anti -CD20, tem mostrado excelentes resultados no tratamento da MW, inclusive naqueles indivíduos que não obtiveram resposta adequada ao tratamento convencional. Nós reportamos o caso de uma mulher de 78 anos de idade com história de fadiga, astenia, anorexia, sonolência, inquietação, urticária, dificuldade para deambular e perda excessiva de peso, aproximadamente 22 kg em um período de cinco meses, cujo tratamento foi realizado com rituximabe. O objetivo deste relato é apresentar uma paciente com diagnóstico de MW e revisar aspectos clínicos e terapêutico atual da doença.

Waldenstrõm's macroglobulinemia is a rare pathology of B lymphocytes characterized by the production of monoclonal IgM, causing clinical manifestations which may include fatigue, asthenia, weight loss, bleeding of the mucosa and intestinal tract, lymphadenomegaly, hepatosplenomegaly and neurological alterations. The disease is more frequent among elderly patients and its symptoms are a result of the hyperviscosity of blood. Waldenstrõm's macroglobulinemia presents hypergammaglobulinemia with a monoclonal peak of serum proteins seen by electrophoresis, high IgM levels and other normal or diminished immunoglobulin levels, immunophenotyping with CD19+, CD20+ and CD24+ B lymphocytes aspirated from hypercellular bone marrow and hypercellular bone marrow biopsy with diffuse infiltration of lymphocytes, plasmocytoid lymphocytes and plasmocytes. Currently, monoclonal antibodies are successfully being used in the treatment of Waldenstrõm's macroglobulinemia. Rituximab, an anti-CD20 monoclonal antibody, has shown excellent results in the treatment of Waldenstrõm's macroglobulinemia even for individuals who did not obtain satisfactory responses to conventional treatment. This work reports the case of a 78-year-old woman with a history of fatigue, asthenia, anorexia, somnolence, restlessness, urticaria, difficulties in walking, and excessive weight loss (approximately 22 Kg within a period of 5 months) who was successfully treated using rituximab. The objective of this report is to present the case of this patient and to review current clinical and therapeutic aspects of the disease.

Conjugação e validação de controle isotípico IgG1-FITC para uso em citometria de fluxo / Conjugation and validation of IgG1-FITC isotype control to be used in flow cytometry

Em meados da década de 50 iniciou-se o desenvolvimento da citometria de fluxo, tecnologia que permite verificar características físico-químicas de células ou partículas suspensas em meio fluido. Esta tecnologia utiliza anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos como ferramenta de investigação em diversas análises e necessita de controles isotípicos para definição da região negativa (background). Estes controles são constituídos por imunoglobulinas de mesmo isotipo e fluorocromo dos anticorpos testes, sendo o isotiocianato de fluoresceína (FITC) o marcador fluorescente mais utilizado na conjugação de anticorpos. Os controles isotípicos têm como função definir a fluorescência inespecífica (células negativas) e as regiões fluorescentes (células positivas). No presente estudo foi selecionado anticorpo monoclonal murino (AcMm) dirigido contra antígeno eritrocitário canino, produzido no Laboratório de Anticorpos Monoclonais do Hemocentro de Botucatu, o qual reage positivamente com hemácias de cães, mas nunca com leucócitos humanos, tendo, portanto, potencial utilidade como controle negativo em citometria de fluxo. A purificação do AcMm da subclasse IgG1 foi feita por cromatografia de afinidade em Proteína-A Sepharose, e o controle da purificação realizado por eletroforese em géis de ágarose e poliacrilamida (SDS-PAGE). A imunoglobulina purificada foi conjugada ao FITC e filtrado em coluna de Sephadex G-25 para separação das proteínas marcadas e não-marcadas. O AcMm conjugado foi testado contra hemácias de cães, e o êxito da conjugação comprovado por testes de fluorescência, sendo a mediana de positividade de 94,70. Frente a leucócitos humanos a mediana de positividade foi 0,03 contra 0,50 dos reagentes comerciais. Os testes estatísticos não-paramétricos de Wilcoxon e correlação de Spearman comprovaram a eficiência e validam o controle isotípico produzido em comparação aos reagentes comerciais testados.

It was during the 1950's that the development of flow cytometry started, technology that allow to measure physiochemical characteristics of cells or suspended particles in fluid. This technology uses monoclonal antibodies labeled by fluorochromes as investigation tool in several analysis and needs isotype controls to define the negative region (background). These controls are constituted by immunoglobulins of the same isotype and fluorochrome from test antibodies, being fluorescein isothiocyanate (FITC) the most fluorescent marker used in antibody conjugations. The isotype controls have the function to define the unspecific fluorescence (negative cells) and the fluorescent regions (positive cells). In this study was selected monoclonal antibody (mAb) against canine erythrocyte antigen, produced in the Monoclonal Antibodies Laboratory - Blood Center of Botucatu, which reacts positively with dog red blood cells, but never with human leukocytes, having therefore, utility potential as negative control in flow cytometry. The purification mAb of IgG1 subclass was made by affinity chromatography in Sepharose Protein-A and the purification control was performed by electrophoresis in ágarose and polyacrylamide gels (SDS-PAGE). The purified immunoglobulin was conjugated to FITC and after was filtered in Sephadex G25 column to separation of labeled and unlabeled proteins. The conjugated mAb was tested against dog red blood cells and the conjugation success was verified by fluorescence tests, being the median positivity of 94.70. To the human leucocytes the positivity median was 0.03 against 0.50 of the commercial reagents. The nonparametric statistical tests of Wilcoxon and the correlation Spearman showed the efficiency and validate the isotype control produced in relation to the tested commercial reagents.

Capture immunoassay for LT detection produced by enterotoxigenic Escherichia coli in bacterial isolates

A capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which detects LT-I toxin produced by enterotoxigenic Escherichia coli strains, has beendeveloped. This capture assay was performed using the IgG enriched fraction of anti-LT-I antiserum and IgG2b anti-LT-I monoclonal antibody and allowed a clear distinction between E. coli LT-I - producing and non-producing strains. The estimated accuracy of the assay is 78% for sensitivity, 94% for specificity and 92% for efficiency. Thus, the capture immunoassayis a sensitive tool for detection of E. coli, which produces heat-labile enterotoxin, and is suitable for use in clinical laboratories and epidemiological surveys in developing world.

O objetivo do presente trabalho foi a padronização de um imunoensaio de captura para detecção de amostras de E. coli produtoras da toxina LT-I. Este ensaio de captura foi desenvolvido utilizando-se a fração enriquecida em IgG do anticorpo policlonal anti-LT e um anticorpo monoclonal caracterizado como IgG2b. Através deste método verificou-se uma clara distinção entre cepas de E. coli produtoras e não produtoras da toxina (p 0,0001), sendo a sensibilidade do método de 78%, a especificidade de 94% e a eficiência de 92%. Assim, o imunoensaio de captura mostrou-se como uma ferramenta sensível para a detecção de amostras de E. coli que produzem a enterotoxina termo-lábil, podendo ser aplicado em laboratórios clínicos e inquéritos epidemiológicos em paises em desenvolvimento.

Capture immunoassay for LT detection produced by enterotoxigenic Escherichia coli in bacterial isolates

A capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which detects LT-I toxin produced by enterotoxigenic Escherichia coli strains, has beendeveloped. This capture assay was performed using the IgG enriched fraction of anti-LT-I antiserum and IgG2b anti-LT-I monoclonal antibody and allowed a clear distinction between E. coli LT-I - producing and non-producing strains. The estimated accuracy of the assay is 78% for sensitivity, 94% for specificity and 92% for efficiency. Thus, the capture immunoassayis a sensitive tool for detection of E. coli, which produces heat-labile enterotoxin, and is suitable for use in clinical laboratories and epidemiological surveys in developing world.

O objetivo do presente trabalho foi a padronização de um imunoensaio de captura para detecção de amostras de E. coli produtoras da toxina LT-I. Este ensaio de captura foi desenvolvido utilizando-se a fração enriquecida em IgG do anticorpo policlonal anti-LT e um anticorpo monoclonal caracterizado como IgG2b. Através deste método verificou-se uma clara distinção entre cepas de E. coli produtoras e não produtoras da toxina (p 0,0001), sendo a sensibilidade do método de 78%, a especificidade de 94% e a eficiência de 92%. Assim, o imunoensaio de captura mostrou-se como uma ferramenta sensível para a detecção de amostras de E. coli que produzem a enterotoxina termo-lábil, podendo ser aplicado em laboratórios clínicos e inquéritos epidemiológicos em paises em desenvolvimento.